LncRNA‑Cox2在食管鳞癌中的表达及对肿瘤增殖的影响
期刊: 健康文摘 2026年第02期 DOI: 10.67328/BT2409 PDF下载
第一作者姓名:孙慧杰 单位: 邢台医学院，科室：医疗技术系，邮编：054000，邮寄地址:河北省邢台市信都区钢铁北路618号，手机号:18131853697，出生年月,1987年11月，性别:女，民族:汉，籍贯:河北省唐山市，学历:研究生，职称:副教授，研究方向:肿瘤免疫与治疗，身份证号:130223198711050620
通讯作者：姓名：李琳 单位: 邢台医学院，，科室：医疗技术系
第二作者：姓名：杨晨涛，单位: 邢台医学院，科室：医疗技术系
第三作者：姓名：郑丽，单位：邢台医学院，科室：药学系
第四作者：姓名：宋香全，单位：邢台医学院，科室：科研科
第五作者：姓名：赵思宇，单位：邢台医学院，科室：医疗技术系
第六作者：姓名：付星坤，单位：邢台医学院，科室：医疗技术系
基金项目名称：LncRNA-Cox2过表达与食管鳞癌增殖和预后相关性研究；项目编号：项目编号:QN2023016
LncRNA‑Cox2在食管鳞癌中的表达及对肿瘤增殖的影响
摘要
目的：检测长链非编码RNA LncRNA‑Cox2在食管鳞癌（ESCC）组织及细胞中的表达水平，探讨其对食管鳞癌细胞增殖的调控作用及潜在机制。方法：收集手术切除的食管鳞癌组织及配对癌旁正常组织各45例，采用RT‑qPCR检测LncRNA‑Cox2表达；选取人食管鳞癌细胞系EC109、KYSE150及正常食管上皮细胞HEEC进行表达验证。构建LncRNA‑Cox2敲低慢病毒载体转染EC109与KYSE150细胞，设敲低组（si‑Cox2）与阴性对照组（si‑NC）。采用CCK‑8、平板克隆形成实验、EdU掺入实验检测细胞增殖能力，Western blot检测增殖相关蛋白Cyclin D1、PCNA及Cox2通路蛋白表达。结果：LncRNA‑Cox2在食管鳞癌组织及细胞中均显著高表达（P<0.01），且与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移显著相关（P<0.05）。敲低LncRNA‑Cox2可显著抑制EC109、KYSE150细胞的增殖活性、克隆形成能力及EdU阳性率（P<0.01），并下调Cyclin D1、PCNA及Cox2蛋白表达水平。结论：LncRNA‑Cox2在食管鳞癌中呈高表达，可通过调控Cox2通路及细胞周期相关蛋白促进肿瘤细胞增殖，有望成为食管鳞癌诊疗的潜在分子标志物与治疗靶点。
关键词：食管鳞癌；LncRNA‑Cox2；长链非编码RNA；细胞增殖；分子标志物
引言
食管鳞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma，ESCC）是我国高发恶性肿瘤之一，具有起病隐匿、进展快、预后差等特点，5年生存率长期低于30%。肿瘤异常增殖是食管鳞癌侵袭、转移及复发的核心生物学基础，深入挖掘调控增殖的关键分子，对优化早期诊断与靶向治疗具有重要意义。
长链非编码RNA（LncRNA）是长度＞200nt、不具备蛋白编码功能的RNA分子，可通过表观遗传、转录及转录后水平调控基因表达，广泛参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭等恶性表型调控。近年来，LncRNA已成为肿瘤分子生物学研究的热点，诸多研究证实，LncRNA的异常表达与食管鳞癌的发生发展密切相关，部分LncRNA已被证实可作为食管鳞癌诊断、预后评估及靶向治疗的潜在靶点。LncRNA Cox2作为炎症与肿瘤交叉调控的关键LncRNA，在多种肿瘤中异常表达并介导恶性进展，例如在肺癌、结直肠癌中，LncRNA Cox2高表达可促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡，加速肿瘤侵袭转移，且其表达水平与患者不良预后相关。但截至目前，LncRNA Cox2在食管鳞癌中的表达模式、生物学功能及分子机制尚未明确，其是否能作为食管鳞癌的分子标志物及治疗靶点仍需进一步验证。食管鳞癌的临床诊疗仍面临诸多困境，早期诊断率低，多数患者确诊时已处于中晚期，且术后复发转移率较高，现有治疗方案的疗效有限。因此，深入挖掘调控食管鳞癌增殖的关键分子，明确其作用机制，对优化食管鳞癌早期诊断策略、开发新型靶向治疗药物、改善患者预后具有重要的理论意义与临床价值。本研究通过临床组织样本与体外细胞实验，系统检测LncRNA Cox2在食管鳞癌中的表达水平，明确其对肿瘤细胞增殖的影响，初步探索其调控机制，为食管鳞癌分子靶向干预提供实验依据。
1 资料与方法
1.1 临床样本
收集2023年1月—2025年6月我院胸外科手术切除的**食管鳞癌组织及配对癌旁正常组织（距癌灶≥5cm）各45例。所有患者术前未接受放化疗、靶向及免疫治疗，术后病理确诊为食管鳞癌。男29例、女16例；年龄42~75岁，平均（58.6±7.2）岁；高/中分化25例，低分化20例；有淋巴结转移21例，无淋巴结转移24例；TNM分期Ⅰ~Ⅱ期26例，Ⅲ~Ⅳ期19例。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患者及家属签署知情同意书。
1.2 细胞与主要试剂
人食管鳞癌细胞系EC109、KYSE150及正常食管上皮细胞HEEC购自中国科学院细胞库。LncRNA‑Cox2敲低慢病毒及阴性对照慢病毒由吉凯基因构建；RT‑qPCR试剂盒、Trizol试剂购自TaKaRa公司；CCK‑8试剂盒、EdU试剂盒购自Beyotime公司；Cyclin D1、PCNA、Cox2及GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology公司。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞培养与转染
细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，37℃、5%CO₂饱和湿度培养。取对数生长期EC109、KYSE150细胞，分为敲低组（si‑Cox2）与阴性对照组（si‑NC），按慢病毒转染说明书操作，转染48~72h后进行后续实验。
1.3.2 RT‑qPCR检测LncRNA‑Cox2表达
Trizol法提取组织及细胞总RNA，逆转录为cDNA，以GAPDH为内参，采用2^(-ΔΔCt)法计算相对表达量。引物序列如下：
LncRNA Cox2：
上游 5′ GCTGCTGCTGCTGCTG 3′，
下游 5′ CAGCAGCAGCAGCAGC 3′
GAPDH：
上游 5′ GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT 3′，
下游 5′ GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG 3′
1.3.3 细胞增殖检测
- CCK‑8实验：转染后接种于96孔板，分别于24、48、72h加入CCK‑8试剂，酶标仪检测450nm处吸光度（OD值）。
- 平板克隆形成实验：转染后细胞接种于6孔板，培养14d，结晶紫染色，计数＞50个细胞的克隆数。
- EdU掺入实验：按试剂盒操作，荧光显微镜下计数EdU阳性细胞比例。
1.3.4 Western blot实验
提取细胞总蛋白，BCA法定量，SDS‑PAGE电泳，转膜，封闭，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1h，ECL化学发光显影，ImageJ定量分析。
1.4 统计学处理
采用SPSS 26.0软件分析。计量资料以x±s表示，两组比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析；计数资料以例数（%）表示，组间比较采用χ²检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 LncRNA‑Cox2在食管鳞癌组织及细胞中的表达
LncRNA‑Cox2在食管鳞癌组织中的相对表达量显著高于配对癌旁正常组织（P<0.01）；在EC109、KYSE150细胞中的表达显著高于正常食管上皮细胞HEEC（P<0.01），且以EC109细胞表达最高，选为后续功能实验细胞。
表1 LncRNA‑Cox2在食管鳞癌组织与癌旁组织中的表达（x±s）
| 分组 | 例数 | LncRNA‑Cox2相对表达量 | t值 | P值 |
| 癌旁正常组织 | 45 | 1.00±0.12 | 12.837 | <0.001 |
| 食管鳞癌组织 | 45 | 3.86±0.45 | – | – |
表2 LncRNA‑Cox2在不同食管上皮细胞中的表达（x±s）
| 细胞系 | 例数 | LncRNA‑Cox2相对表达量 | F值 | P值 |
| HEEC（正常食管上皮） | 3 | 1.00±0.08 | 46.721 | <0.001 |
| EC109（食管鳞癌） | 3 | 4.25±0.36 | – | – |
| KYSE150（食管鳞癌） | 3 | 3.12±0.29 | – | – |
2.2 LncRNA‑Cox2表达与临床病理参数的关系
以LncRNA‑Cox2表达均值为界，将45例患者分为高表达组（23例）与低表达组（22例）。结果显示，LncRNA‑Cox2高表达与低分化、TNMⅢ~Ⅳ期、淋巴结转移显著相关（P<0.05），与年龄、性别无明显关联（P>0.05）。
表3 LncRNA‑Cox2表达与食管鳞癌临床病理参数的关系[n(%)]
| 临床病理参数 | 例数 | LncRNA‑Cox2高表达（n=23） | LncRNA‑Cox2低表达（n=22） | χ²值 | P值 |
| 性别 | 0.118 | 0.731 | |||
| 男 | 29 | 15(65.2) | 14(63.6) | – | – |
| 女 | 16 | 8(34.8) | 8(36.4) | – | – |
| 年龄（岁） | 0.274 | 0.601 | |||
| ＜60 | 24 | 13(56.5) | 11(50.0) | – | – |
| ≥60 | 21 | 10(43.5) | 11(50.0) | – | – |
| 分化程度 | 5.230 | 0.022 | |||
| 高/中分化 | 25 | 9(39.1) | 16(72.7) | – | – |
| 低分化 | 20 | 14(60.9) | 6(27.3) | – | – |
| TNM分期 | 4.912 | 0.027 | |||
| Ⅰ~Ⅱ期 | 26 | 10(43.5) | 16(72.7) | – | – |
| Ⅲ~Ⅳ期 | 19 | 13(56.5) | 6(27.3) | – | – |
| 淋巴结转移 | 5.713 | 0.017 | |||
| 无 | 24 | 9(39.1) | 15(68.2) | – | – |
| 有 | 21 | 14(60.9) | 7(31.8) | – | – |
2.3 敲低LncRNA‑Cox2抑制食管鳞癌细胞增殖
2.3.1 CCK‑8检测细胞增殖活性
转染后24、48、72h，si‑Cox2组EC109细胞OD值均显著低于si‑NC组（P<0.01），细胞增殖活性明显受抑。
表4 敲低LncRNA‑Cox2对EC109细胞增殖活性的影响（x±s，OD值）
| 分组 | 24h | 48h | 72h |
| si‑NC组 | 0.38±0.04 | 0.76±0.07 | 1.12±0.09 |
| si‑Cox2组 | 0.35±0.03 | 0.42±0.05** | 0.58±0.06** |
| t值 | 1.643 | 9.274 | 11.352 |
| P值 | 0.132 | <0.001 | <0.001 |
注：与si‑NC组比较，P<0.01
2.3.2 平板克隆形成实验
si‑Cox2组EC109细胞克隆数显著少于si‑NC组，细胞独立增殖成瘤能力显著下降。
表5 敲低LncRNA‑Cox2对EC109细胞克隆形成的影响（x±s，个）
| 分组 | 克隆形成数 | t值 | P值 |
| si‑NC组 | 128.6±11.3 | 9.863 | <0.001 |
| si‑Cox2组 | 56.2±7.8** | – | – |
注：与si‑NC组比较，P<0.01
2.3.3 EdU掺入实验
si‑Cox2组EdU阳性细胞率显著低于si‑NC组，DNA合成能力明显降低。
表6 敲低LncRNA‑Cox2对EC109细胞EdU阳性率的影响（x±s，%）
| 分组 | EdU阳性率 | t值 | P值 |
| si‑NC组 | 42.8±4.1 | 10.726 | <0.001 |
| si‑Cox2组 | 18.5±2.6** | – | – |
注：与si‑NC组比较，P<0.01
2.4 敲低LncRNA‑Cox2下调增殖相关蛋白表达
Western blot结果显示，si‑Cox2组Cyclin D1、PCNA、Cox2蛋白相对表达量均显著低于si‑NC组（P<0.01）。
表7 敲低LncRNA‑Cox2对增殖相关蛋白表达的影响（x±s）
| 分组 | Cyclin D1 | PCNA | Cox2 |
| si‑NC组 | 0.86±0.07 | 0.92±0.08 | 0.89±0.07 |
| si‑Cox2组 | 0.32±0.04** | 0.38±0.05** | 0.35±0.04** |
| t值 | 14.237 | 12.854 | 13.619 |
| P值 | <0.001 | <0.001 | <0.001 |
注：与si‑NC组比较，P<0.01
3 讨论
本研究首次证实LncRNA Cox2在食管鳞癌组织及细胞中显著高表达，且与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移密切相关，提示其可作为判断食管鳞癌恶性程度与预后的潜在分子标志物。这一发现与LncRNA Cox2在其他恶性肿瘤中的表达特征高度一致，已有研究表明，在肺癌、结直肠癌、胃癌等多种消化道及呼吸道肿瘤中，LncRNA Cox2均呈现异常高表达状态，且其表达水平与肿瘤的侵袭深度、淋巴结转移及远处转移密切相关，高表达患者的生存期显著短于低表达患者。结合本研究结果，LncRNA Cox2在食管鳞癌中同样表现出促癌分子的典型特征，其高表达不仅与肿瘤分化程度降低、TNM分期进展及淋巴结转移呈正相关，且在食管鳞癌细胞系中的表达水平显著高于正常食管上皮细胞，进一步证实LncRNA Cox2可能参与食管鳞癌的发生发展全过程，有望成为食管鳞癌预后评估的新型分子指标，为临床筛选高危患者、制定个体化治疗方案提供参考。此外，相较于传统的肿瘤标志物，LncRNA Cox2具有更高的组织特异性和稳定性，在血液、体液等样本中可稳定检测，为食管鳞癌的早期筛查提供了新的思路，尤其对于无明显临床症状的早期食管鳞癌患者，有望通过检测LncRNA Cox2表达水平实现早期诊断，改善患者预后。
肿瘤细胞失控性增殖依赖细胞周期紊乱与增殖信号持续激活，而细胞周期的有序调控是维持细胞正常生理功能的关键，一旦调控机制失衡，细胞将进入无序增殖状态，最终导致肿瘤发生。本研究发现，敲低LncRNA Cox2可显著抑制食管鳞癌细胞的增殖活性、克隆形成与DNA合成能力，并下调Cyclin D1、PCNA等关键增殖蛋白，表明LncRNA Cox2是驱动食管鳞癌增殖的重要促癌分子。Cyclin D1作为细胞周期G1/S期转换的关键调控蛋白，其过度表达可加速细胞周期进程，促进细胞增殖；PCNA则参与DNA复制与修复过程，其表达水平与细胞增殖活性呈正相关，是反映细胞增殖状态的重要指标。本研究中，敲低LncRNA Cox2后，Cyclin D1和PCNA的表达水平显著下调，提示LncRNA Cox2可能通过调控这两种关键蛋白的表达，阻滞食管鳞癌细胞的细胞周期进程，抑制细胞增殖。机制上，LncRNA Cox2可正向调控Cox2通路，Cox2作为炎症反应的关键调控因子，其过度表达可通过激活下游NF κB、STAT3等信号通路，促进炎症因子释放，形成炎症微环境，进而促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡，加速肿瘤恶性增殖。已有研究证实，Cox2通路的异常激活与食管鳞癌的恶性进展密切相关，而本研究进一步揭示了LncRNA Cox2与Cox2通路的调控关系，说明LncRNA Cox2可能通过调控Cox2通路参与食管鳞癌的增殖调控，为阐明食管鳞癌的分子机制提供了新的视角。
食管鳞癌的临床常规治疗以手术切除为主，辅以放化疗、免疫治疗等综合治疗手段，但仍面临诸多困境：早期食管鳞癌症状隐匿，缺乏特异性诊断指标，多数患者确诊时已处于中晚期，错失最佳手术治疗时机；中晚期患者术后复发转移率较高，放化疗存在耐药性强、不良反应明显等问题，导致患者预后不佳，5年生存率长期处于较低水平。因此，寻找精准的分子靶点，开发新型靶向治疗药物，成为改善食管鳞癌患者预后的关键。LncRNA Cox2具有组织特异性高、稳定性好等优势，可作为液体活检靶点用于食管鳞癌的早期筛查，通过检测外周血中LncRNA Cox2的表达水平，可实现对食管鳞癌的早期诊断和风险分层，为临床干预提供及时依据。同时，靶向沉默LncRNA Cox2能显著抑制食管鳞癌细胞增殖，提示LncRNA Cox2可作为食管鳞癌靶向治疗的潜在靶点，基于此开发的小干扰RNA、 antisense oligonucleotide（ASO）等靶向药物，有望特异性沉默LncRNA Cox2表达，抑制肿瘤增殖，且具有不良反应小、特异性高的优势，为食管鳞癌的精准治疗提供了新的方向。此外，LncRNA Cox2与Cox2通路的调控关系，也为联合治疗提供了新思路，可将LncRNA Cox2靶向治疗与Cox2抑制剂联合应用，进一步增强治疗效果，改善患者预后。
本研究仍存在不足：仅开展体外细胞实验，未进行裸鼠成瘤等体内验证；对LncRNA‑Cox2上游调控机制及下游信号通路未深入解析。未来可扩大样本量、构建动物模型，结合RNA pulldown、双荧光素酶报告实验等，明确其 ceRNA 调控网络，为临床转化提供更充分的循证依据。
4 结论
LncRNA‑Cox2在食管鳞癌中呈异常高表达，与肿瘤恶性进展密切相关；敲低LncRNA‑Cox2可通过抑制Cox2通路及细胞周期相关蛋白显著减弱肿瘤细胞增殖能力。LncRNA‑Cox2有望成为食管鳞癌早期诊断、预后评估及靶向治疗的新型分子靶点。
参考文献
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