辅酶Q10经影响Nrf2/HO-1通路表达调控帕金森大鼠氧化应激的实验研究

夏芳莲¹ 梁海山² 叶维萍³ 唐婷婷² 万婷²

1. 赣州市南康区第一人民医院睡眠心理科 江西南康 341400
   
2. 赣州市南康区第一人民医院神经内科 江西南康 341400
   

3、赣州市南康区第一人民医院门诊部 江西南康 341400

摘要：目的 基于Nrf2/HO-1通路，探究辅酶Q10对帕金森病（PD）大鼠氧化应激的调控作用及机制。方法 60只SD雄性大鼠（清洁级）以MPTP腹腔注射制备PD模型，随机分为6组（各10只）：对照组、辅酶Q10组、Nrf2-NC组、模型组、辅酶Q10+ATRA组及ATRA组。辅酶Q10（5 mg/kg）、ATRA（7 mg/kg）及两药联合分别灌胃给药，Nrf2-NC组及对照、模型组予生理盐水，连续8周。干预后行行为学评分；检测黑质MDA、SOD、GSH-Px；免疫组化检测TH阳性神经元比例及小胶质细胞活化数；RT-PCR检测Nrf2、Hmox1 mRNA；Western blotting检测核Nrf2、HO-1、TNF-α、COX-2、OX-42蛋白。结果 模型组较对照组行为学评分、MDA、小胶质活化及TNF-α/COX-2/OX-42表达升高，SOD/GSH-Px、TH阳性神经元、核Nrf2/HO-1降低（P<0.05）；辅酶Q10可逆转上述变化，ATRA作用相反，联合组可拮抗辅酶Q10的效应（P<0.05）。结论 PD大鼠多巴胺能神经元损失减少，氧化应激与炎症水平下降，其机制与辅酶Q10激活Nrf2/HO-1通路有关。

关键词： 辅酶Q10；Nrf2/HO-1信号通路；帕金森病；氧化应激

以肌强直、静止性震颤、运动迟缓为主要特征的帕金森病（PD），好发于中老年群体，其病理本质在于黑质多巴胺能神经元减少与路易小体沉积，可致患者生活自理能力严重下降^[1]。氧化应激在PD发病中起核心驱动作用，过量活性氧（ROS）可致多巴胺能神经元氧化损伤，且介导炎症及凋亡过程^[2]。Nrf2/HO-1通路是机体抗氧化防御的核心调控机制，Nrf2激活后转入核内启动HO-1等下游基因转录，介导抗氧化、抗炎及抗凋亡效应^[3]。辅酶Q10是线粒体电子传递链的重要成分，具有清除自由基及缓解氧化应激的潜力，但其是否通过Nrf2/HO-1通路介导PD抗氧化应激效应，尚缺乏实验依据^[4-5]。本研究通过复制PD大鼠模型，观察辅酶Q10对PD氧化应激的影响及Nrf2/HO-1通路的参与机制，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

• 1. 
     材料
     

实验动物：60只体质量280~300 g、8周龄的SD雄性大鼠（清洁级），购自中国医学科学院医学实验动物研究所[生产许可证号：SCXK（京）2021-0006]，置于恒湿（55±5）%、12 h昼夜节律、恒温（22±2）℃环境中饲养，自由饮水摄食。

主要试剂：辅酶Q10（纯度≥98%，标准品）、ATRA（Nrf2抑制剂，纯度≥98%）、MPTP；兔抗Nrf2、HO-1、TNF-α、COX-2、OX-42及酪氨酸羟化酶（TH）抗体；山羊抗IBA1抗体；HRP标记二抗；总RNA提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、Trizol试剂。

主要仪器：脑立体定位仪、冰冻切片机、激光扫描共聚焦显微镜、实时荧光定量PCR仪、垂直电泳转印系统、化学发光成像仪。

• 1. 
     建模与分组干预
     

除对照组给予等量生理盐水外，其余各组每日腹腔注射MPTP 30 mg/kg（0.1 ml/10 g），连续7d。上述大鼠经1周适应性喂养后，已按随机抽签法预先分配至6个实验组（各组10只）：对照组、ATRA组、辅酶Q10组、模型组、Nrf2-NC组及辅酶Q10+ATRA组。造模后第2天开始给药：辅酶Q10组予5 mg/kg辅酶Q10灌胃（生理盐水配成0.50 mg/ml混悬液）；ATRA组予7 mg/kg ATRA灌胃（生理盐水配成0.70 mg/ml溶液）；Nrf2-NC组予10 ml/kg生理盐水灌胃；联合组予辅酶Q10（5 mg/kg）+ATRA（7 mg/kg）灌胃，对照组及模型组予等量生理盐水，各组1次/d×8周。

• 1. 
     行为学观察
     

末次给药12 h后评分：0分（正常），1分（拒捕减弱、竖毛、少动），2分（迟缓伴震颤/步态不稳），4分（步态不稳/旋转），6分（单侧瘫痪、进食难），8分（全瘫、体质量下降），10分（濒死/死亡）。

• 1. 
     组织取材与氧化应激检测
     

行为学观察结束后，每组麻醉5只大鼠后，其心脏接着灌注4%多聚甲醛，再取脑固定；另5只断颈处死，冰浴条件下分离双侧黑质组织，部分制备为10%匀浆，置-70 ℃保存。离心取上清，采用相应试剂盒检测MDA（硫代巴比妥酸法）、SOD（邻苯三酚自氧化法）、GSH-Px（二硫代二硝基苯甲酸法）水平。

• 1. 
     免疫组化检测
     

固定脑组织脱水包埋（OCT），20 μm冠状切片。切片修复抗原、5%山羊血清封闭，加TH（1∶200）或IBA1（1∶200）一抗及HRP二抗孵育，DAB显色，苏木精复染，树脂封片。每片取5个视野，计算TH阳性面积比及IBA1阳性小胶质活化数。

• 1. 
     RT-PCR检测
     

冻存黑质组织经Trizol法提取总RNA，逆转录合成cDNA。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因，通过2^-ΔΔCt法对Notch1、Hmox1、Hes1、Nrf2 mRNA进行相对定量分析。引物由生工生物（上海）设计并合成，序列见表1。

表1 引物序列

引物	正向序列（5′-3’）	反向序列（5′-3’）	长度/bp
GAPDH	TGATGGGTGTGAACCACGAG	AGTGATGGCATGGACTGTGG	152
Nrf2	GGTGGCCAAGCACTTCAAAC	GAACGGTTCATACCTTGCCG	116
Hmox1	ACCTGAGGAGAGAGAAACCG	TCAGTCAGCCAAGCTAGGGA	228
Notch1	CACACCGCTGTTGACAGAGAA	CTCCAGGCAAACAATGTCCC	80
Hes1	CTAGCCTTAGCAAGCCAGAGAAT	ACTATATGCACTGAGCCCGT	281

• 1. 
     Western blotting检测
     

黑质组织蛋白提取后BCA定量。50 μg蛋白电泳转膜，5%BSA封闭。一抗（Nrf2/TNF-α/OX-42/HO-1/COX-2按1∶500，β-actin/Lamin B1按1∶1000）4℃过夜，二抗（1∶1000）37℃ 4h。ECL显色成像，Image-J分析灰度值。

• 1. 
     统计学分析
     

应用SPSS 26.0软件行单因素方差分析，组间比较采用SNK-q检验。计量资料以（±s）表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组行为学评分及氧化应激指标比较

各组分值及氧化应激中，模型组MDA升、抗氧化酶降（P<0.05）；辅酶Q10组改善，ATRA组恶化，联合组居中（P<0.05），见表2。

表2 各组行为学评分及氧化应激指标比较（±s，n=10）

组别	行为学评分（分）	MDA（nmol/mg prot）	SOD（U/mg prot）	GSH-Px（U/mg prot）
对照组	0.85±0.21	2.15±0.32	182.45±14.32	96.32±7.85
模型组	6.48±0.75¹	6.72±0.68¹	94.56±9.45¹	47.68±5.42¹
辅酶Q10组	3.18±0.48²	3.42±0.38²	158.32±11.56²	84.56±6.78²
ATRA组	7.85±0.62²	8.25±0.75²	71.25±7.82²	34.25±4.56²
Nrf2-NC组	6.35±0.71	6.58±0.62	97.45±9.82	49.12±5.68
辅酶Q10+ATRA组	5.12±0.58³	5.15±0.52³	118.56±10.25³	63.45±5.85³

与对照组比较：¹P<0.05；与模型组比较：²P<0.05；与辅酶Q10组比较：³P<0.05。

2.2 各组黑质多巴胺能神经元及小胶质细胞比较

模型组TH阳性神经元减少、小胶质细胞增多（P<0.05）；辅酶Q10组逆转上述变化（P<0.05）；ATRA组作用相反（P<0.05）；联合组削弱辅酶Q10效应（P<0.05）。见表3、图1。

表3 各组黑质多巴胺能神经元及小胶质细胞比较（±s，n=10）

组别	TH阳性神经元比例（%）	小胶质细胞数目（个/视野）
对照组	46.32±4.85	11.25±2.31
模型组	14.85±2.64¹	49.36±5.21¹
辅酶Q10组	39.56±4.12²	21.45±3.62²
ATRA组	8.32±1.85²	64.25±6.32²
Nrf2-NC组	15.62±2.85	47.82±5.12
辅酶Q10+ATRA组	23.45±3.12³	36.82±4.25³

与对照组比较：¹P<0.05；与模型组比较：²P<0.05；与辅酶Q10组比较：³P<0.05。

图1 各组黑质区TH免疫组化染色（×200）

2.3 Nrf2/HO-1通路mRNA表达比较

模型组Nrf2/Hmox1低表达、Notch1/Hes1高表达（P<0.05）；辅酶Q10组逆转上述趋势（P<0.05）；ATRA组Nrf2/Hmox1低于模型组（P<0.05）；联合组Nrf2/Hmox1低于辅酶Q10组（P<0.05）。见表4。

表4 Nrf2/HO-1通路mRNA表达比较（±s，n=5）

组别	Nrf2 mRNA	Hmox1 mRNA	Notch1 mRNA	Hes1 mRNA
对照组	1.00±0.10	1.00±0.10	1.00±0.10	1.00±0.10
模型组	0.52±0.07¹	0.45±0.06¹	1.85±0.15¹	1.72±0.14¹
辅酶Q10组	1.38±0.12²	1.25±0.11²	1.12±0.10²	1.08±0.09²
ATRA组	0.25±0.04²	0.22±0.03²	2.35±0.18²	2.18±0.16²
Nrf2-NC组	0.55±0.07	0.48±0.06	1.82±0.14	1.75±0.13
辅酶Q10+ATRA组	0.82±0.08³	0.68±0.07³	1.55±0.12³	1.42±0.11³

与对照组比较：¹P<0.05；与模型组比较：²P<0.05；与辅酶Q10组比较：³P<0.05。

2.4炎性蛋白水平及Nrf2/HO-1通路的组间对比

模型组Nrf2/HO-1低表达、炎症蛋白高表达（P<0.05）；辅酶Q10组逆转上述变化（P<0.05）；ATRA组反之（P<0.05）；联合组介于二者之间（P<0.05）。见表5、图2。

表5 炎性蛋白水平及Nrf2/HO-1通路的组间对比（±s，n=5）

组别	核Nrf2蛋白	HO-1蛋白	TNF-α蛋白	COX-2蛋白	OX-42蛋白
对照组	0.88±0.09	0.92±0.09	0.22±0.03	0.25±0.03	0.20±0.03
模型组	0.38±0.05¹	0.35±0.05¹	0.88±0.08¹	0.92±0.09¹	0.85±0.08¹
辅酶Q10组	1.22±0.11²	1.18±0.10²	0.32±0.04²	0.35±0.04²	0.28±0.04²
ATRA组	0.20±0.03²	0.18±0.03²	1.15±0.10²	1.18±0.11²	1.08±0.09²
Nrf2-NC组	0.40±0.06	0.38±0.05	0.85±0.08	0.88±0.08	0.82±0.07
辅酶Q10+ATRA组	0.62±0.07³	0.58±0.06³	0.65±0.06³	0.68±0.07³	0.55±0.06³

与对照组比较：¹P<0.05；与模型组比较：²P<0.05；与辅酶Q10组比较：³P<0.05。

图2 炎性及通路相关蛋白表达

3讨论

PD的发病涉及多种机制，其中氧化应激在多巴胺能神经元退变中扮演关键角色。MPTP可特异性损伤黑质多巴胺能神经元，是建立PD动物模型的常用工具药。本研究经腹腔注射MPTP成功复制PD大鼠模型，模型组大鼠呈现明显行为学异常，黑质TH阳性神经元显著减少，证实模型制备成功。

在氧化应激条件下，ROS生成增多，抗氧化酶活性受抑，MDA蓄积，SOD等活性降低。本研究中，PD大鼠SOD及GSH-Px活性降低，黑质MDA升高，提示模型动物存在显著的氧化应激损伤。辅酶Q10干预后，MDA水平明显回落，SOD与GSH-Px活性显著回升，表明辅酶Q10对PD大鼠氧化应激损伤具有确切的缓解作用。辅酶Q10兼具电子传递与脂溶性抗氧化双重属性，能直接清除自由基、维护线粒体功能稳定，其治疗应用已拓展至心血管疾病之外的多个领域^[6]。

静息时Nrf2与Keap1结合于胞质，氧化应激触发Nrf2磷酸化后入核，启动HO-1等下游基因转录，介导抗氧化、抗炎及抗凋亡效应，是机体最重要的内源性抗氧化防御机制之一^[7]。本研究中，PD模型大鼠黑质核Nrf2及HO-1表达均显著下调，提示PD状态下该通路处于抑制状态；辅酶Q10干预则明显增强Nrf2核转位及HO-1表达，说明辅酶Q10的抗氧化效应与激活Nrf2/HO-1通路密切相关。

为验证Nrf2/HO-1通路在辅酶Q10抗氧化作用中的贡献，本研究采用Nrf2抑制剂ATRA进行干预。结果显示，ATRA单独使用可加剧PD大鼠氧化应激损伤，进一步抑制Nrf2/HO-1通路活性；而辅酶Q10联合ATRA后，辅酶Q10的氧化应激改善效应被部分抵消。该结果证实，辅酶Q10至少部分经由Nrf2/HO-1通路发挥抗PD氧化应激作用。抗氧化策略在神经退行性疾病治疗中具有广阔前景，但仍面临一定挑战^[8]。

炎症反应参与PD病程进展。小胶质细胞激活后释放炎性因子，加重多巴胺能神经元损害。此外，OX-42是小胶质细胞活化的特异性标记。本研究发现，辅酶Q10可明显下调OX-42、TNF-α及COX-2表达水平，减少小胶质细胞活化数量，提示其抗炎效应同样与Nrf2/HO-1通路激活有关。Nrf2/HO-1通路可通过抑制NF-κB信号传导，降低下游促炎因子表达，从而缓解炎症损伤^[9]。此外，本研究还检测了Notch1/Hes1 mRNA表达，发现辅酶Q10可下调其水平，提示Nrf2/HO-1通路可能与Notch信号存在交叉调控，共同参与PD病理过程。既往研究亦表明，辅酶Q10可通过miR-149-5p/MMPs等新型通路发挥抗氧化作用，提示其保护机制具有多靶点特征，但具体交互机制仍需深入探索^[10]。

综上所述，Nrf2/HO-1通路激活介导了辅酶Q10的神经保护效应，可缓解PD大鼠氧化应激与炎症，并减轻黑质多巴胺能神经元损失，为PD的辅助治疗提供了新的实验依据。

参考文献

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基金资助：赣州市重点研发计划项目（编号：GZ2024YLJ250）

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